La PCR digitale ou dPCR

La PCR digitale ou dPCR

La PCR digitale (dPCR) est une technique dérivée de la PCR classique, utilisée pour la quantification précise des acides nucléiques (ADN ou ARN). Les étapes de thermocyclage restent similaires à celles de la PCR classique.

Contrairement à la qPCR, qui mesure l'accumulation de produit en temps réel, la dPCR divise l'échantillon en de nombreuses réactions individuelles, permettant une détection plus sensible et précise des molécules cibles, même en très faible quantité. Dans cet exemple d’un échantillon contenant 0,1 % de séquences mutées. En qPCR, le signal de la séquence mutée est masqué par celui des séquences abondantes. En dPCR, chaque compartiment permet une détection indépendante des séquences mutées, rendant l’analyse plus sensible.

 Chaque compartiment reçoit un fragment de l’échantillon et agit comme une réaction PCR indépendante. La détection s’effectue à l’aide de sondes fluorescentes. La dPCR peut être multiplexée pour détecter plusieurs amplifications (2 à 5) selon les fabricants. Chaque compartiment est soit 'positif' (amplification), soit 'négatif'.

Encapsulation par dPCR en microgouttelettes : L’échantillon est fractionné en microgouttelettes de quelques nanolitres pour permettre l'analyse individuelle.

Deux systèmes possibles : 1. Système avec microgouttelettes partitionnées sur un support (thermocyclage et lecture intégrés). 2. Système découplé avec des étapes d’amplification et de lecture séparées. La quantification absolu utilise une méthode statistique.

Avantages de la PCR digitale

1. Quantification absolue :
   • Contrairement à la qPCR, la dPCR ne nécessite pas de courbes standard pour quantifier les molécules d'ADN. La quantification est absolue, ce qui permet une précision accrue.
2. Sensibilité accrue :
   • La dPCR est capable de détecter des quantités extrêmement faibles d'ADN cible, ce qui la rend particulièrement utile pour l'analyse de mutations rares, la détection d'ADN résiduel dans les cancers, ou encore les pathogènes à très faible abondance.
3. Robustesse :
   • Les variations dans l'efficacité de la PCR (inhérentes à la qPCR) n'affectent pas la dPCR, car chaque compartiment est analysé de manière binaire (présence ou absence d'amplification).

Limites de la PCR digitale

1. Coût :
   • La dPCR nécessite un matériel spécifique pour le partitionnement de l'échantillon et la détection des résultats, ce qui peut représenter un coût plus élevé que la PCR classique ou la qPCR.
2. Volume d’échantillon :
   • La quantité d’échantillon requise peut être importante en fonction du nombre de partitions souhaitées, surtout pour des échantillons très dilués.
3. Temps d’analyse :
   • Bien que précise, la dPCR peut être plus longue que la qPCR, en raison des étapes de partitionnement et de lecture des résultats.

Applications en biologie médicale

1. Oncologie :
   • Détection de mutations rares dans les cancers, suivi de la charge tumorale résiduelle après traitement.
2. Virologie :
   • Quantification précise des charges virales (par exemple dans l'infection par le VIH, l’hépatite ou d'autres virus).
3. Microbiologie :
   • Détection de pathogènes rares ou difficiles à quantifier par des techniques classiques.
4. Analyse de mutations génétiques :
   • Diagnostic prénatal ou néonatal pour la détection de mutations ponctuelles ou de délétions génétiques.